【實驗解讀】

差示掃描熒光法（DSF），也被稱為thermal shift assay（TSA），是表征蛋白熱穩(wěn)定性的常用方法之一，廣泛應(yīng)用于蛋白配體互作表征，突變體、緩沖液、去垢劑篩選等領(lǐng)域。

DSF可以通過熒光染料或蛋白內(nèi)源熒光信號監(jiān)測升溫過程中蛋白構(gòu)象的變化計算其解鏈溫度Tm（折疊蛋白與去折疊蛋白相等時的溫度）。染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，蛋白去折疊疏水區(qū)暴露時，疏水染料SYPRO Orange便會結(jié)合至該區(qū)域，熒光強(qiáng)度增加（圖1）。無標(biāo)記DSF則是基于蛋白去折疊過程中色氨酸發(fā)射光譜的位移進(jìn)行檢測（圖2）。

當(dāng)配體的結(jié)合增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性時，其解鏈溫度Tm也會升高。如下圖所示，未加入ATP時，Hsp90 蛋白的Tm為63.46℃，在加入ATP后，結(jié)合增強(qiáng)了Hsp90蛋白的穩(wěn)定性，Tm升高至67.53℃。因此我們可以利用該方法進(jìn)行蛋白結(jié)合活性的快速驗證或高通量配體定性初篩。

在進(jìn)行蛋白配體互作表征時，染料法DSF存在一定的局限性。外源加入的染料結(jié)合至蛋白可能會直接影響蛋白的穩(wěn)定性或干擾蛋白與配體的結(jié)合，并且在蛋白形成聚集時，染料會發(fā)生解離，不適用于多結(jié)構(gòu)域蛋白的檢測。例如醛脫氫酶1A1 (ALDH1A1)在用SYPRO Orange染料檢測時僅有一個熱變性峰，并且在加入輔因子NAD+和已知的抑制劑NCT-501后并沒有出現(xiàn)明顯的Tm變化（圖4a）。而使用PR蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行無標(biāo)記DSF檢測時，ALDH1A1呈現(xiàn)出兩個熱變性峰，在加入輔因子NAD+后，第一個熱變性峰明顯右移。繼續(xù)加入抑制劑NCT-501后，第一個熱變性峰消失，蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)（圖4b）[1]。

此外，染料法DSF的實驗操作較繁瑣，需要根據(jù)蛋白的特性及去垢劑兼容性選擇合適的染料，優(yōu)化蛋白和染料的比例，在配制樣品時還要考慮染料自帶的有機(jī)溶劑對蛋白的影響。而用PR蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行無標(biāo)記DSF實驗時，稀釋好樣品就可以直接上機(jī)檢測了。

小編也準(zhǔn)備了完整的上機(jī)檢測視頻供大家參考 ??

【實驗操作演示-使用PR Panta進(jìn)行TSA實驗】

除了無標(biāo)記DSF（nanoDSF）檢測模塊外，PR蛋白穩(wěn)定性分析儀還可搭載動態(tài)光散射（DLS），靜態(tài)光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模塊，只需要10μl樣品就可以完成均一性，熱穩(wěn)定性，膠體穩(wěn)定性的檢測。我們還提供自動化解決方案，便于客戶進(jìn)行無人值守的高通量篩選。

[1] Labrou N E.Targeting Enzymes for Pharmaceutical Development Methods and Protocols: Methods and Protocols[J]. Methods in Molecular Biology, 2020.