首先，轉(zhuǎn)錄因子是什么？直接上概念，轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors, TFs)指能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。對于這個概念需要重點關(guān)注的是1、轉(zhuǎn)錄因子主要功能是來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平；2、這種調(diào)節(jié)是通過結(jié)合DNA來實現(xiàn)的；3、結(jié)合的DNA具有序列特異性。因此對于研究一個轉(zhuǎn)錄因子，需要重點闡述清楚這兩個事情，一個是結(jié)合的DNA是什么，特異性的結(jié)合序列是哪些， 二是可能調(diào)控的基因是什么。那么對于轉(zhuǎn)錄因子，闡述清楚這兩個就可以了嗎？這也太小看轉(zhuǎn)錄因子了，我們坐下來慢慢說。

還是回到第一個問題，轉(zhuǎn)錄因子是什么？其實對于大多數(shù)基因而言，更為重要的是這個基因是轉(zhuǎn)錄因子嗎？這個問題其實不難，現(xiàn)在通過基因的同源注釋即可以推測這個基因是不是一個轉(zhuǎn)錄因子，背后原因在于轉(zhuǎn)錄因子都具有保守的結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合域和調(diào)控域，尤為重要的是其中的結(jié)合域，原因在于一方面，結(jié)合域直接決定了他的結(jié)合DNA的情況，另外結(jié)合域的保守性決定了這個轉(zhuǎn)錄因子到底是哪個家族。因此，針對某些物種基因組注釋沒有那么透徹同時又關(guān)注某個轉(zhuǎn)錄因子家族的老師，對研究物種中某個轉(zhuǎn)錄因子家族基因進行全局鑒定也是研究的方向，是一個短平快的文章很好的選擇（怎么做呢？與常規(guī)修飾酶鑒定等方法一致，還不清楚的話，參考前期文章https://igenebook.biomart.cn/news/3041979.htm）

第一個問題解決了，那第二個問題來了，轉(zhuǎn)錄因子功能是什么？我們都知道他調(diào)控了基因的表達，那調(diào)控基因是為了什么呢？這個問題其實就是一個基因功能的驗證的問題，主要可以從兩個方面考慮，首先，表達量，轉(zhuǎn)錄因子表達有時空特異性，例如NKX1-2轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細胞分化過程中高度表達，推測與研究證明其與脂質(zhì)生成相關(guān)。干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）是IRF家族的成員，主要在淋巴細胞中表達，并在淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此對于某些轉(zhuǎn)錄因子在不同組織類型或者生命過程中具有明顯較高的表達豐度，則可推測其與該生命活動中具有較高相關(guān)性。另外就是經(jīng)典基因功能驗證實驗，過表達或者敲除、沉默轉(zhuǎn)錄因子，通過表型鑒定等推測其功能。

功能已經(jīng)知道了，那下面就要解析機制了。這時候就是要回歸到轉(zhuǎn)錄因子本身功能特性:第一，與特異性DNA序列結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，第二，與其他蛋白互作完成功能。因此我們需要解決的主要就是這兩個機制。首先我們先關(guān)注互作的蛋白是誰，這個就需要通過CoIP等實驗進行互作的蛋白鑒定，其互作蛋白的特性也賦予了轉(zhuǎn)錄因子功能上的多樣性，具體功能就需要針對互作蛋白具體蛋白具體分析了。另外就是這個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列到底是什么。這個時候就需要利用經(jīng)典的蛋白和DNA互作的研究手段來進行鑒定了，現(xiàn)在主流的技術(shù)手段包括ChIP-seq和CUT-Tag。其中ChIP-seq即染色質(zhì)免疫共沉淀測序，實驗上是通過染色質(zhì)提取后，利用特異性的抗體捕獲特異性的蛋白（即我們關(guān)注的轉(zhuǎn)錄因子）同時將轉(zhuǎn)錄因子上結(jié)合的DNA進行捕獲，隨后將DNA進行建庫測序分析，就可以知道結(jié)合的DNA到底是什么了。CUT-Tag也是當(dāng)前利用手段較多的研究蛋白和DNA互作的方法，其原理是抗體進入細胞核后特異性識別和結(jié)合目的蛋白，隨后引導(dǎo)Tn5轉(zhuǎn)座酶在抗體結(jié)合區(qū)域進行切割和擴增，隨后通過測序就可以知道結(jié)合的DNA序列是什么。ChIP-seq體系穩(wěn)定成熟，適用于大多數(shù)情況，CutTag其背景信號更干凈，且起始量低，適用于珍惜樣本。

測序數(shù)據(jù)下機是一堆的reads，那怎么分析才能知道結(jié)合的序列是什么呢？ChIP和CutTag分析流程大體一致，基本原理是找到reads顯著性堆疊的區(qū)域，即peak區(qū)域，則該peak區(qū)域即為分析上蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域。怎么來理解這個邏輯，原因在于在實際實驗過程中，只有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域才能夠被多次捕獲，那么捕獲測序的DNA就會明顯多于其他地方（即顯著性堆疊），因此這些peak區(qū)域就可以推測為蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域。那怎么找到peak呢，現(xiàn)在通用的就是利用MACS2軟件進行call peak（具體MACS2的原理我們就不再解釋了，簡單說就是知道reads很多的地方）。那么針對另外一個問題，怎么知道序列的特異性呢？就需要對peak進行motif（保守結(jié)合基序）的分析，常用軟件包括Homer、MEME、MEME-ChIP等，都是很好的進行motif分析的工具，結(jié)果都是被認可的。拿到peak之后，我們就可以對peak進行關(guān)聯(lián)基因，就可以知道結(jié)合DNA最有可能調(diào)控的基因是哪些，不過這個時候需要注意，因為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA最終目的是調(diào)控基因表達，那這些基因有沒有差異表達呢？這個還是需要通過轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)和ChIP的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析才可以知道，對于聯(lián)合分析結(jié)果進一步進行基因分析等，就可以進一步推測基因功能，并且與前期的功能驗證實驗結(jié)合更系統(tǒng)有力地闡述轉(zhuǎn)錄因子的功能。

最后就需要對ChIP等的結(jié)果進行驗證了，一般是對重點關(guān)注的結(jié)合的DNA（或者說基因）進行驗證，常用用的技術(shù)手段包括ChIP-qPCR、EMSA、酵母單雜、雙熒光素酶等實驗。這樣就有更充分的證據(jù)來說明轉(zhuǎn)錄因子確實結(jié)合了關(guān)鍵性的基因區(qū)域，完成了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控該基因的表達的功能。

這時候，一個基本的文章就完成了，首先對轉(zhuǎn)錄因子進行了鑒定，對其“身份”信息進行了確定，隨后對其表達模式進行了研究，并且通過敲除或者過表達驗證其功能，緊接通過互作蛋白和結(jié)合DNA的鑒定，并對重要基因進行驗證，最后發(fā)揮一下想象力，構(gòu)建一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一切完美。

如果還是覺得怎么這么麻煩，那您考慮換個方案，找一下我們--武漢愛基百客生物科技有限公司，從前面基因的鑒定，到中間表達模式分析，到CoIP驗證互作蛋白鑒定、ChIP/Cut-Tag尋找結(jié)合DNA和motif，到ChIP-qPCR、EMSA等的驗證，給您提供一條龍的服務(wù)，您提供材料，我們一起探索其中的奧秘。

當(dāng)然，轉(zhuǎn)錄因子功能的復(fù)雜性也遠不止于此，先鋒轉(zhuǎn)錄因子？轉(zhuǎn)錄因子和增強子？轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列DNA甲基化選擇性？這個也不可能只通過這一個思路就完成，我們有機會下次再聊，現(xiàn)在的思路也是一個敲門磚式的研究，推開這個大門，一點一點揭露其神秘面紗。不過，他山之石可以攻玉，我們也整理了一些轉(zhuǎn)錄因子研究可以用到的網(wǎng)站，包括動植物的已有的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)站，轉(zhuǎn)錄因子抗體怎么選擇，轉(zhuǎn)錄因子motif查詢，已經(jīng)做了的人和小鼠的ChIP數(shù)據(jù)怎么看，基因啟動子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測等，關(guān)注愛基百客公眾號，后臺回復(fù)“ 轉(zhuǎn)錄因子?”，我們整體打包給您，讓您對手上的轉(zhuǎn)錄因子有個更清晰的認知。