干細(xì)胞是未分化的生物細(xì)胞，是可以專門分化的細(xì)胞，并且可以分裂（通過有絲分裂）以產(chǎn)生更多的干細(xì)胞。它們存在于多細(xì)胞生物中。在哺乳動物中，干細(xì)胞有兩種類型：從胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)中分離出來的胚胎干細(xì)胞和在各種組織中發(fā)現(xiàn)的原代細(xì)胞。在成年生物中，干細(xì)胞和原代細(xì)胞可以用作人體的修復(fù)系統(tǒng)，以補(bǔ)充成年組織。在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞可以分化為所有專門的細(xì)胞-外胚層，內(nèi)胚層和中胚層-但可以維持再生器官（例如血液，皮膚或腸道組織）的正常周轉(zhuǎn)。

精密醫(yī)學(xué)：源自患者的干細(xì)胞中色素性視網(wǎng)膜炎的基因修復(fù)

來自患者成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）可用作自體細(xì)胞的來源，用于視網(wǎng)膜疾病的移植。但是，患者來源的iPSC仍然攜帶病原突變。為了生成健康的患者源細(xì)胞，一種基于短回文重復(fù)序列（CRISPR）/Cas9的細(xì)菌系統(tǒng)（簇狀分布）的基因編輯技術(shù)可用于修復(fù)突變，從而產(chǎn)生不需要患者免疫抑制的新型植物。研究人員測試了CRISPR / Cas9是否可以用于患者特異性iPSC中以精確修復(fù)導(dǎo)致X連鎖性色素性視網(wǎng)膜炎（XLRP）的RPGR點(diǎn)突變。從XLRP患者的針頭活檢培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生具有患者c.3070G> T突變的iPSC。使用CRISPR指導(dǎo)RNA，Cas9核酸內(nèi)切酶和供體同源性轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSC。盡管該基因具有重復(fù)序列和富含GC的序列，但RPGR基因拷貝中有13％顯示出基因突變糾正和轉(zhuǎn)化為野生型等位基因。這是首次使用CRISPR糾正患有感光細(xì)胞變性患者的iPSC中的致病突變。這一重要的概念驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)支持針對視網(wǎng)膜疾病的個(gè)性化基于iPSC的移植治療的發(fā)展。

CRISPR /Cas9β-globin基因靶向人類造血干細(xì)胞

β-血紅蛋白病，如鐮狀細(xì)胞病和β-地中海貧血，是由β-球蛋白（HBB）基因突變引起的，并影響全球數(shù)百萬人。研究人員提出了一種CRISPR / Cas9基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)將Cas9核糖核蛋白和腺相關(guān)病毒載體同源供體結(jié)合在一起，以移植人造血干細(xì)胞，該造血干細(xì)胞可以在患者來源的造血干細(xì)胞中進(jìn)行體外基因校正，然后進(jìn)行自體移植。在造血干細(xì)胞的HBB基因上實(shí)現(xiàn)了同源重組。值得注意的是，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)富集模型，以超過90％的靶向整合率純化造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。研究人員還表明，通過使用患者來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，它們可以分化為紅細(xì)胞并表達(dá)成年β-球蛋白（HbA）信使RNA，從而有效地糾正了導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞病的Glu6Val突變。這證實(shí)了細(xì)胞編輯的HBB等位基因的完全轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？傊?，這些臨床前研究概述了一種基于CRISPR的方法，該方法通過HBB位點(diǎn)的同源重組靶向造血干細(xì)胞，從而促進(jìn)了β-血紅蛋白病的下一代療法的發(fā)展。

CRISPR–Cas9誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的修復(fù)導(dǎo)致大量缺失和復(fù)雜的重排

CRISPR–Cas9有望成為臨床環(huán)境中首選的基因編輯工具。到目前為止，Cas9誘導(dǎo)的遺傳變化的探索僅限于靶位點(diǎn)的近端和遠(yuǎn)距離脫靶序列，并且得出結(jié)論CRISPR-Cas9具有合理的特異性。研究人員報(bào)道了主要的目標(biāo)誘變，例如小鼠胚胎干細(xì)胞，小鼠造血祖細(xì)胞和人類分化的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有大量的靶位點(diǎn)缺失和更復(fù)雜的基因組重排。研究人員使用了長讀測序和長距離PCR基因分型方法，發(fā)現(xiàn)單個(gè)向?qū)NA/Cas9引入的DNA斷裂通常被解析為多堿基缺失。另外，在切口部位的遠(yuǎn)端處發(fā)現(xiàn)了病變和交叉事件。 CRISPR–Cas9編輯引起的有絲分裂活躍細(xì)胞中觀察到的基因組損傷可能是致病的。

由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U?（基于CRISPR / Cas9技術(shù)）在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而且CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率并輕松實(shí)現(xiàn)敲除（KO），體外和體內(nèi)的點(diǎn)突變（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U? Ubigene已成功編輯了100多個(gè)細(xì)胞系的基因。

Reference

Bassuk, A., Zheng, A., Li, Y. et al. Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells. Sci Rep 6, 19969 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19969

Dever, D., Bak, R., Reinisch, A. et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature 539, 384–389 (2016). https://doi.org/10.1038/nature20134

Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765–771 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4192

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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