實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以成為定量的依據(jù)。

Real-timePCR原理

1.1?熒光染料和熒光探針

實時熒光定量 PCR 的化學原理包括探針類和非探針類兩種。非探針類則是利用熒光染料（如SYBR Green I）或者特殊設計的引物(如LUX Primers)來指示擴增的增加。???探針類(TaqMan探針和 分子信標)是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。探針類由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但實時熒光定量 PCR則簡便易行。

1.2?SYBR GreenI工作原理?

SYBR Green I是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波長約為497nm ，發(fā)射波長最大約為520nm。????在PCR反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

1.3?LUX 引物工作原理?

LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結構，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結構打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。

1.4?TaqMan探針工作原理

1.5?分子信標（molecular beacon）工作原理

分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結構中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。

1.6?熒光閾值(Threshold)?

Ct值是擴增DNA的量達到閾值時候的循環(huán)次數(shù)。Ct 值與起始模板的關系研究表明，每個模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。????利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表 Ct 值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)

Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析

基線（baseline)：通常是3－15個循環(huán)的熒光信號，同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。

閾值（threshold)：自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。

手動設置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關系

分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。

相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是

2-△△Ct?。或者是考慮擴增效率的Pfaffl法。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

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