前言

保守的Ser/Thr蛋白激酶mTORC1是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞合成代謝過程和途徑的核心催化成分，它在溶酶體表面被激活。激活mTORC1需要兩個必要條件：首先，mTORC1被V-ATPase-Ragulator-Rag復(fù)合物引入到溶酶體表面，以響應(yīng)氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)；其次，mTORC1被溶酶體結(jié)合的GTP酶Rheb激活，以應(yīng)對生長因子-PI3K-AKT-TSC1/2信號途徑。mTORC1最著名的底物是兩種調(diào)節(jié)蛋白合成的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和eIF4E結(jié)合蛋白（4EBP）。此外，mTORC1還可以通過SREBP和PPAR-γ調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和脂肪組織分化。

最近一些研究表明，溶酶體不僅控制mTORC1的活化，而且還接收來自mTORC1的信號，以調(diào)節(jié)許多重要的生物過程。一個關(guān)鍵問題是，一旦mTORC1在溶酶體表面被激活，它是否磷酸化，并通過局部溶酶體蛋白發(fā)出信號。

本篇為2022年4月，由德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Yonghao Yu研究團隊在Nature Communications（IF：17.674）期刊上發(fā)表了題為 “Quantitative phosphoproteomic analyses identify STK11IP as a lysosome-specific substrate of mTORC1 that regulates lysosomal acidification”的研究成果，本文作者運用磷酸化蛋白組學(xué)、TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)、非靶向代謝組學(xué)等組學(xué)方法，對溶酶體蛋白質(zhì)組與mTORC1調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白質(zhì)組的交叉參考分析，將STK11IP鑒定為mTORC1的溶酶體特異性底物，隨后對STK11IP進行敲除等研究，結(jié)果表明STK11IP磷酸化是mTORC1調(diào)節(jié)溶酶體酸化和自噬的一種機制，并指出STK11IP是改善自噬信號異常疾病的一個潛在的治療靶點。

研究思路

研究結(jié)果

1.mTORC1調(diào)控溶酶體磷酸化蛋白質(zhì)組的綜合分析

因為蛋白質(zhì)磷酸化的豐度低，所以細(xì)胞器水平的研究是個挑戰(zhàn)。為了克服這個問題，作者開發(fā)一種方法。首先，使用質(zhì)譜儀分別檢測了溶酶體蛋白質(zhì)組和總的mTORC1調(diào)控的磷酸化蛋白質(zhì)組。然后，交叉引用了兩個數(shù)據(jù)集，并用生物信息學(xué)提取了潛在的溶酶體特異性mTORC1底物。

使用免疫沉淀（IP）實驗分離溶酶體（圖1 a），運用蛋白質(zhì)組實驗從中鑒定出了231種蛋白質(zhì)。GO分析表明，這些蛋白大多分布在液泡和溶酶體，富集到囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、內(nèi)吞作用和離子轉(zhuǎn)運生物學(xué)過程，這都與溶酶體生物學(xué)功能有關(guān)。

使用基于還原二甲基化的定量質(zhì)譜方法，檢測了由胰島素控制的肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組（在原代大鼠肝細(xì)胞中）及其關(guān)鍵的下游激酶，包括Akt，mTORC1和S6K。與溶酶體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)對比，共鑒定出45種蛋白質(zhì)（圖1 b，c）。然后，從肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中提取了作為潛在mTORC1底物的蛋白質(zhì)，即雷帕霉素處理后磷酸化減少，S6K抑制劑處理后磷酸化不變的蛋白質(zhì)。STK11IP也在溶酶體蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中被鑒定出來（圖1 b，c）。

圖1 mTORC1調(diào)節(jié)溶酶體磷酸化蛋白質(zhì)組的綜合分析

2.?STK11IP是mTORC1的溶酶體特異性底物

STK11IP的磷酸化在雷帕霉素處理后顯著降低，與已知的mTORC1磷酸化基序一致。實驗發(fā)現(xiàn)STK11IP（pS404）的磷酸化模式與其他已知的mTORC1底物ULK1（pS757）相似，但與已知的S6K底物不同。這些結(jié)果表明STK11IP（pS404）可能是mTORC1的直接底物。

生成了針對STK11IP/pS404的磷酸化特異性抗體，發(fā)現(xiàn)pS404被雷帕霉素和mTOR激酶抑制劑有效抑制。但是S6K抑制劑對該磷酸化位點無效（圖1 d）。對STK11IP序列的檢查表明，該蛋白含有潛在的TOS基序，這個TOS基序(F567A)中關(guān)鍵殘基(F567)的突變?nèi)∠薙TK11IP和Raptor之間的結(jié)合（圖1 e）。這進一步證明了STK11IP是mTORC1的直接底物。免疫共染色顯示，溶酶體中存在STK11IP（圖1 f）。

3.?STK11IP缺乏促進自噬

許多mTORC1底物通過反饋機制調(diào)節(jié)其活化，但是實驗沒有觀察到對照細(xì)胞和STK11IP敲除（KO）原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）細(xì)胞之間mTORC1活性有任何差異。使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)生成STK11IP KO細(xì)胞，并與WT-、S404A-或S404D-STK11IP進行重組。然后進行了氨基酸饑餓實驗，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中的mTORC1活性沒有差異。

隨后，研究了STK11IP是否可以介導(dǎo)mTORC1下游的某些生物過程，mTORC1可通過其下游靶蛋白（例如TFEB和ULK1）參與控制自噬。實驗發(fā)現(xiàn)pS404-STK11IP的下調(diào)與自噬水平的上調(diào)同時發(fā)生，例如FBS或FBS/葡萄糖饑餓時LC3I到LC3II的轉(zhuǎn)化率增加，還觀察到pS404-STK11IP的下調(diào)與LC3的降解一起發(fā)生。這些結(jié)果表明，STK11IP可能作為mTORC1的下游靶標(biāo)來調(diào)節(jié)自噬。

為了驗證，使用CRISPR-Cas9敲除HEK293T細(xì)胞中的STK11IP。與對照相比，自噬體數(shù)的標(biāo)志物L(fēng)C3II在STK11IP KO細(xì)胞中顯著增加（圖2a，b）。此外，STK11IP KO細(xì)胞中的LC3點（內(nèi)源性LC3）或GFP-LC3點（使用GFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞）更多（圖2c，d）。

自噬通量是自噬活性的可靠指標(biāo)，于是作者進行了LC3周轉(zhuǎn)率測定，來比較WT和STK11IP KO細(xì)胞之間的自噬通量。結(jié)果表明STK11IP KO使自噬通量增加了約兩倍（圖2 e，f）。使用另外一種自噬通量測量方法（熒光探針GFP-LC3-RFP），表明STK11IP KO細(xì)胞中的自噬通量增強（圖2 k）?？偟膩碚f，與野生型細(xì)胞相比，STK11IP?/?細(xì)胞中自噬體和自溶酶體的形成均顯著增加（圖2 i）。因此，當(dāng)STK11IP被刪除時，自噬通量增加。

為了研究mTORC1介導(dǎo)的STK11IP磷酸化在自噬中的作用，作者在STK11IP KO細(xì)胞中表達了WT-，S404A-或S404D-STK11IP?？偟慕Y(jié)果表明，STK11IP在S404處的去磷酸化也促進了自噬通量（圖2j-o）。

接下來，利用STK11IP KO小鼠來確定STK11IP是否調(diào)節(jié)體內(nèi)自噬。自噬最有效的生理誘導(dǎo)劑之一是運動，使用WT和STK11IP KO同窩仔進行了耐力運動測試。發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，STK11IP KO小鼠在靜息和耐力運動條件下在比目魚肌中表現(xiàn)出更高水平的LC3II轉(zhuǎn)化（圖2 p，q）。總的來說，結(jié)果表明STK11IP KO促進體內(nèi)自噬通量。

圖2 STK11IP缺失促進自噬

4. STK11IP與V-ATP酶結(jié)合以調(diào)節(jié)溶酶體酸化

自噬是一個多步驟的過程，包括起始、自噬體形成和自噬體-溶酶體融合，沒有發(fā)現(xiàn)對照組與STK11IP KO細(xì)胞的溶酶體生物發(fā)生和溶酶體形態(tài)水平有任何差異。觀察到STK11IP KO細(xì)胞中的溶酶體相對于對照組的酸性更強（圖3a）。此外，與表達WT-STK11IP或S404D-STK11IP突變體的細(xì)胞相比，用S404A-STK11IP突變體重建的STK11IP KO細(xì)胞也顯示出更多的酸性溶酶體（圖3 b）。使用比例探頭來檢測溶酶體pH值（基于黃色/藍(lán)色信號的比率），表明STK11IP KO細(xì)胞和S404A-STK11IP表達細(xì)胞的pH值顯著降低（圖3 c，d）。使用pH 4.5納米探針（pH閾值為4.5）時，只能在STK11IP KO和S404A-STK11IP重組細(xì)胞中檢測到激活的TMR信號（圖3 e，f），這與前面檢測的結(jié)果一致。推測溶酶體通過質(zhì)子泵送V型ATPase維持其pH梯度，所以研究了STK11IP是否對V-ATPase活性有影響。檢測發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，從STK11IP KO和S404A-STK11IP細(xì)胞分離的溶酶體中V-ATPase的活性增強（圖3 g，j）。

使用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)對STK11IP WT和KO細(xì)胞進行了分析，發(fā)現(xiàn)STK11IP KO對V-ATPase各種組分的表達沒有影響。然后使用TurboID系統(tǒng)來研究STK11IP是否可以與V-ATPase復(fù)合物相互作用（圖3 k）。確定了V-ATP酶復(fù)合物的幾種成分，包括ATP6V1B，ATP6V1A和ATP6V1H（圖3 l）。使用co-IP進一步驗證了STK11IP與V-ATPase復(fù)合物的各個亞基之間的相互作用。有趣的是，發(fā)現(xiàn)與WT蛋白相比，S404A-STK11IP突變體與V-ATPase組分（ATP6V1A和ATP6V1B）形成較弱的相互作用（圖3 m）。這些數(shù)據(jù)表明，mTORC1介導(dǎo)的STK11IP在S404處的磷酸化對于其與V-ATPase復(fù)合物的相互作用至關(guān)重要。

綜上，mTORC1信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)STK11IP在S404處的磷酸化。STK11IP在S404處的去磷酸化削弱了其與V-ATPase的相互作用。STK11IP的去磷酸化導(dǎo)致V-ATP酶活性增加，溶酶體酸性增加，自溶酶體形成增強，自噬通量增強（圖3o）。

圖3 STK11IP調(diào)節(jié)溶酶體酸化

5.?STK11IP缺乏可預(yù)防空腹和MCD引起的脂肪肝

為了研究STK11IP在小鼠中的生理功能，測量了STK11IP在小鼠組織中的表達譜。qRT-PCR和免疫印跡分析結(jié)果顯示，STK11IP在肝臟、白脂肪細(xì)胞組織（WAT）和胰腺中的表達較高。

在禁食36小時后，發(fā)現(xiàn)pS404-STK11IP的磷酸化水平降低。STK11IP KO小鼠顯示出LC3I到LC3II轉(zhuǎn)化率增加（圖4 a）。這些結(jié)果進一步表明，STK11IP及其對pS404的磷酸化可能在這一過程中發(fā)揮作用。這種自噬的增強顯著改善了空腹誘導(dǎo)的脂肪肝，表現(xiàn)為STK11IP KO小鼠中脂滴的減少（圖4 b-d）。血清和肝臟中的TG和NEFA（非酯化脂肪酸）水平也隨之降低（圖4 e-g）。這些觀察結(jié)果與之前的報告一致，即自噬在長期禁食期間促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖。

為了進一步了解STK11IP KO后的代謝重塑，對從WT和STK11IP KO小鼠收獲的血清非靶向代謝組學(xué)分析。分析顯示糖生成、酮體代謝、脂肪酸β-氧化以及甜菜堿或肉堿代謝顯著富集，這可以解釋為什么長期饑餓后STK11IP KO小鼠的葡萄糖水平較高而TG水平較低（圖e-h）。在饑餓時，自噬產(chǎn)生的脂肪酸和氨基酸可用于驅(qū)動糖異生和生酮。隨著饑餓的繼續(xù)，脂肪和肌肉組織的降解在向肝臟提供底物方面發(fā)揮著越來越大的作用，肝臟輸出葡萄糖和酮體來喂養(yǎng)其他組織。

利用了由蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)的NASH模型。兩周后，與WT小鼠相比，STK11IP KO小鼠的體重下降相似，然而，與對照細(xì)胞相比，STK11IP KO小鼠的肝臟顯示出LC3II / LC3I比率增加（圖4 j）。STK11IP KO小鼠表現(xiàn)出肝脂肪變性降低，如大囊泡脂滴減少所示（圖4 k，l）和血清和肝組織中TG水平的下調(diào)（圖4 m，n）。

圖4 STK11IP缺乏癥可保護小鼠免受代謝紊亂的侵害

研究討論

總的來說，使用磷酸化蛋白組+常規(guī)定量蛋白質(zhì)組學(xué)等一系列研究方法，可以將STK11IP鑒定為mTORC1的新型溶酶體特異性底物。STK11IP的敲除導(dǎo)致自噬通量的強勁增加。STK11IP在Ser處（404）的去磷酸化抑制STK11IP作為自噬抑制劑的作用。在機制上，STK11IP與V-ATPase結(jié)合，并調(diào)節(jié)V-ATPase的活性。敲除STK11IP可保護小鼠免受空腹或蛋氨酸/膽堿缺乏飲食（MCD）誘導(dǎo)的脂肪肝。因此，研究表明，STK11IP磷酸化是mTORC1調(diào)節(jié)溶酶體酸化和自噬的一種機制，并指出STK11IP是改善具有異常自噬信號傳導(dǎo)的疾病的潛在治療靶點。

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通過溶酶體蛋白質(zhì)組與mTORC1調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白質(zhì)組的交叉參考分析，將STK11IP鑒定為mTORC1的溶酶體特異性底物。通過對STK11IP的研究，發(fā)現(xiàn)它能調(diào)節(jié)溶酶體酸化和自噬溶酶體的形成。這為靶向STK11IP治療具有異常自噬信號傳導(dǎo)的疾病提供了基礎(chǔ)。

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