NAI-N3 是一種可進(jìn)行 RNA 純化的 RNA ?；噭?。NAI-N3 是雙功能 SHAPE（選擇性2-羥基?；头治鰧?shí)驗(yàn)）探針（RNA 結(jié)構(gòu)探針和富集）。

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　　Nature Biotechnology雜志上刊登了來自新加坡A*STAR基因研究所Niranjan Nagarajan和Yue Wan團(tuán)隊(duì)合作發(fā)表的文章“Determination of isoform-specific RNA structure with nanopore long read”（共同第一作者是Jong Ghut Ashley Aw、Shaun W. Lim和Jia Xu Wang），他們通過基于納米孔測序技術(shù)（PORE-cupine；一種長讀長測序方法）結(jié)合化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)探針以及機(jī)器學(xué)習(xí)來探測細(xì)胞內(nèi)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

　　RNA上化學(xué)修飾引起的變化可以在直接RNA測序中被探測到

　　在納米孔測序技術(shù)中，RNA分子穿過一個(gè)生物孔，通過測量電流可以直接對(duì)分子進(jìn)行測序。RNA分子中的自然修飾會(huì)造成電流擾動(dòng)，引起的可解碼信號(hào)異常能夠揭示基因組上修飾的位置和特征。原則上，人為造成的化學(xué)修飾同樣可以解碼信號(hào)，但是能否用于研究全長RNA的結(jié)構(gòu)還尚未確定。為了確定能夠在直接測序中探測到信號(hào)變化的化學(xué)探針，文章中測試了可以修飾單鏈堿基的5種不同的結(jié)構(gòu)探針復(fù)合物，包括能夠引起2’羥基?；腟HAPE試劑：N-methylisatoic anhydride（NMIA，N-甲基異酐）、2-methylnicotinic acid imidazolide（NAI， 2-甲基煙酸咪唑胺）和2-methylnicotinic acid imidazolide azide（NAI-N3，2-甲基煙酸咪唑胺疊氮化物），堿基特異性的化學(xué)探針：dimethyl sulfate（DMS，硫酸二甲酯）和1-cyclohexyl-3-（2-morpholinoethyl） car bodiimide metho-p-toluenesulfonate（CMCT，1-環(huán)己基-3-（2-嗎啉基）碳二亞胺甲基對(duì)甲苯磺酸鹽）。實(shí)驗(yàn)用到的模式生物是四膜蟲屬（Tetrahymena），其RNA有著明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

　　被上述化合物處理修飾過和未修飾的RNA接上接頭并連接一個(gè)動(dòng)力蛋白，然后使用納米孔 MinION系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行直接測序（圖1a）。相比于沒有修飾的RNA，文章中從修飾的RNA中檢測到了更多的堿基錯(cuò)配、刪除和插入事件。這表明在全長RNA的研究中，同樣可以直接檢測到由化學(xué)修飾引起的錯(cuò)誤事件，并且通過接收者操縱特征曲線下的面積（AUC-ROC）分析發(fā)現(xiàn)由NAI-N3引起的修飾在四膜蟲屬的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中最容易被檢測到（圖1bcd），表明在直接測序信號(hào)檢測的進(jìn)一步優(yōu)化中，NAI-N3是其中比較適合的一種結(jié)構(gòu)探針復(fù)合物。

圖1 (a)直接RNA測序并進(jìn)行信號(hào)處理示意圖，RNA加入結(jié)構(gòu)探針和直接測序，檢測到特征的電壓信號(hào)。沒有加入結(jié)構(gòu)探針的信號(hào)作為預(yù)測修飾的訓(xùn)練集；(bcd)不同復(fù)合物處理四膜蟲RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)后被檢測到的表現(xiàn)（分別是錯(cuò)配、刪減和插入事件）

　　生物活性

　　體外研究

　　活細(xì)胞用icSHAPE（體內(nèi)點(diǎn)擊選擇性2-羥基?；头治鰧?shí)驗(yàn)）化學(xué)NAI-N3處理，然后選擇性化學(xué)富集NAI-N3修飾的RNA，與利用深度測序的類似方法相比，該方法提供了更高的信噪比。MCE試劑:https://www.activeinhibitor.com/cck8/