新冠疫情使得“核酸檢測”家喻戶曉，PCR檢測作為金標(biāo)準(zhǔn)承擔(dān)了無限重任。然而由于PCR是變溫過程，對實(shí)驗(yàn)環(huán)境、儀器設(shè)備等有嚴(yán)格要求，具有一定的局限性，偏遠(yuǎn)地區(qū)、縣級醫(yī)院開展核酸檢測非常不方便。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于其擴(kuò)增期間反應(yīng)條件溫和、不需要特殊的儀器設(shè)備，能真正意義上實(shí)現(xiàn)分子POCT而更受矚目。

主流核酸檢測技術(shù)比較

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)多種多樣，其所用酶的多樣性，決定了等溫?cái)U(kuò)增原理的千差萬別。LAMP和RPA是目前應(yīng)用最為廣泛的兩種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，商業(yè)化程度也是最高的。今天我們就來對LAMP、RPA、PCR技術(shù)做一個(gè)清晰的比較。

主流核酸檢測技術(shù)的原理

• PCR技術(shù)原理圖

• LAMP技術(shù)原理圖

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出來的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，是利用多引物在60-65℃高溫下進(jìn)行單酶介導(dǎo)的指數(shù)擴(kuò)增，在擴(kuò)增產(chǎn)物上，以大小不一、成環(huán)雙鏈DNA為主。

• RPA技術(shù)原理圖

RPA,即重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，是在由多種酶和蛋白的參與下，在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸指數(shù)擴(kuò)增的技術(shù)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。

RPA的反應(yīng)過程，首先是重組酶與引物結(jié)合，形成蛋白-DNA復(fù)合物。接著在dsDNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。而被替換的DNA鏈與SSB（單鏈DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合，防止進(jìn)一步被替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。