通過核轉(zhuǎn)染法將gRNA載體（含Cas9）和Donor共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，gRNA和Cas9復(fù)合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞以外源攜帶目標(biāo)點突變的Donor作為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），將目標(biāo)點突變重組到基因組靶位點。

gRNA載體攜帶抗性，可進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點擴(kuò)增及測序，篩選出點突變純合的陽性克隆。

點突變方案：

服務(wù)流程及質(zhì)量控制

應(yīng)用案例

PSEN1基因A79V突變可引起阿爾茨海默癥。研究表明，將阿爾茨海默癥患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞（iPSC），然后通過用野生型序列替換點突變序列，修正突變的基因。通過研究患者的iPSC和修正后的iPSC，可以得知該突變對細(xì)胞表型的影響，從而深入研究該突變的病理性作用。

iPSC中PSEN1基因的序列分析

A_點突變修正后的雜合子測序結(jié)果。

B_ 點突變修正后的純合子測序結(jié)果（T>C）

Reference：

?Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S.(2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of

contamination with host cell proteins.?Biotechnology progress, e2820.

來源 | 源井生物

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。

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