Western blot（WB）是檢測蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的經(jīng)典方法，可在簡單或復(fù)雜的生物樣品中提供有關(guān)靶蛋白的半定量或定量數(shù)據(jù)。WB步驟復(fù)雜，通常包括：

蛋白樣本制備→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→顯影→分析。

WB任何過程出現(xiàn)Bug均可影響結(jié)果的重復(fù)性與靈敏度，因此必須注意將WB的每個(gè)步驟標(biāo)準(zhǔn)化。今天給大家分享WB各個(gè)過程中需要注意的細(xì)節(jié)！

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1.樣品制備

有效的樣品制備是影響WB可重復(fù)性的非常重要的因素。需考慮以下問題：

1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，細(xì)胞質(zhì)/膜蛋白？

2、溶解的蛋白或其翻譯后修飾的維持是否需要添加額外的緩沖成分(例如洗滌劑、酶抑制劑)？
3、蛋白質(zhì)定量的方法是什么，緩沖成分會(huì)干擾蛋白定量嗎？

BCA蛋白定量檢測法是總蛋白質(zhì)定量的常用方法，其蛋白間差異較考馬斯染料法的更小，但與還原劑、螯合劑不兼容（兼容去垢劑）。

2.電泳

1、最合適的凝膠濃度是什么？

不同分子量的蛋白分離膠濃度對(duì)應(yīng)表：

2、哪種電泳緩沖液最合適？

例如，3-(N-嗎啡啉）丙磺酸緩沖液（MOPS緩沖液）適合~75KDa的蛋白質(zhì)，2-(N-嗎啉基)乙磺酸緩沖液(MES緩沖液)適合<36KDa的蛋白質(zhì)。

3、電泳多長時(shí)間和以及電泳條件？

4、蛋白質(zhì)的分子量遷移情況如何？

蛋白質(zhì)的分子量遷移因凝膠類型、濃度和電泳緩沖液的不同而不同。對(duì)應(yīng)情況如下：

3.轉(zhuǎn)膜

?1、什么是最合適的膜？

例如，PVDF膜或NC膜（0.45μm）。PVDF膜有兩種規(guī)格，0.45μm的膜適用于檢測大于20KDa的蛋白質(zhì)，0.2μm膜適用于小于20的蛋白質(zhì)。PVDF需要在甲醇中浸泡1-2min激活。

不同分子量蛋白轉(zhuǎn)膜條件：

大于150KDa蛋白可恒壓20V 4度濕轉(zhuǎn)過夜。

2、轉(zhuǎn)膜液甲醇濃度如何？
小分子量蛋白的轉(zhuǎn)膜需要注意：

（1）高濃度的凝膠有利于小分子量蛋白的分離。一般在目的蛋白離凝膠前沿0.5-1cm時(shí)停止電泳，太靠近凝膠前沿易引起邊緣效應(yīng)。
（2）SDS阻止蛋白與膜的結(jié)合，小蛋白更是如此。因此電轉(zhuǎn)液中可以不加SDS。

（3）保持甲醇濃度20%。

大分子量蛋白的轉(zhuǎn)膜需要注意：

（1）???而甲醇易使SDS從蛋白上脫離，因此適當(dāng)降低甲醇濃度至10%或更低，防止蛋白沉淀。

（2）???降低電轉(zhuǎn)液中甲醇的含量，這樣可以促進(jìn)凝膠的膨脹，更易于大分子量蛋白的轉(zhuǎn)出。

（3）???使用硝酸纖維素膜時(shí)，甲醇是必需的。如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)液，但需要預(yù)先用甲醇活化。

3、是否應(yīng)進(jìn)行膜染色以評(píng)估轉(zhuǎn)膜效率？麗春紅染色可在膜上看見清晰、連續(xù)的粉紅色條帶，無白色圈圈出現(xiàn)。轉(zhuǎn)膜不佳時(shí)，條帶色淡、有氣泡，甚至無條帶。

4.封閉

封閉液中可與固相載體表面的空白位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上。
1、何種封閉液最合適（例如BSA或脫脂牛奶）？

脫脂奶粉成分復(fù)雜（多種蛋白質(zhì)的混合物），磷酸化抗體可能會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗猩锼兀荒苡糜谏锼貥?biāo)記的抗體系統(tǒng)。BSA也是非常常用的封閉液，但BSA可能含有IgG或其他血清蛋白等污染，這些蛋白可以與某些抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，增加非特異性信號(hào)。

但需注意，過度封閉也會(huì)導(dǎo)致靶蛋白的信號(hào)強(qiáng)度變?nèi)?。研究者發(fā)現(xiàn)有些抗體在室溫下孵育2-4小時(shí)會(huì)產(chǎn)生比在4℃溫育過夜時(shí)更強(qiáng)的信號(hào)。

2、封閉液應(yīng)該使用什么濃度(例如，2.5%)和什么緩沖液(例如，TBST)？

5.孵育一抗

1、一抗的一般特征是什么(例如單克隆兔IgG)？

2、一抗對(duì)天然蛋白或變性蛋白特異嗎？識(shí)別表位序列/區(qū)域是否已知？

3、一抗是否存在已知的其他條帶？
蛋白質(zhì)分子量不對(duì)時(shí)蛋白質(zhì)可能存在降解，翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、前體蛋白剪切等。

4、是否設(shè)置了適當(dāng)?shù)膶?duì)照以確定抗體的特異性？

使用陽性和陰性對(duì)照可以容易地確定抗體的特異性。最好的陽性對(duì)照是過表達(dá)目標(biāo)蛋白的純化蛋白質(zhì)或裂解物，而最好的陰性對(duì)照是來自敲除動(dòng)物組織的組織或細(xì)胞裂解物。

如果無法獲得過表達(dá)目標(biāo)蛋白的純化蛋白或裂解物，許多公司如Aviva Systems Biology，Cell SignalingTechnology和Santa Cruz Biotechnology都可以獲得許多組織和細(xì)胞的裂解物，可用作陽性對(duì)照（已知靶蛋白在這些組織或細(xì)胞中高度表達(dá)）。

6.孵育二抗

1、二抗是什么標(biāo)記結(jié)合的（HRP或熒光）？

2、二抗是否特異性針對(duì)一抗？

3、是否存在可檢測/過度曝光的信號(hào)，如果是，是否需要調(diào)整抗體濃度？

7.顯影

1、采用什么顯影方法（化學(xué)發(fā)光還是熒光）？

2、顯影相關(guān)試劑是否正確儲(chǔ)存？

3、膜是否可以剝離抗體進(jìn)行重新檢測？哪種抗體剝離緩沖液最適合我的實(shí)驗(yàn)？?

8.分析

1、目的條帶是否在檢測系統(tǒng)的線性范圍內(nèi)？

2、哪種量化方法最適合(全泳道或分析單獨(dú)目的條帶)？

3、歸一化方法是什么？

使用內(nèi)參蛋白是歸一化的常用方法，其前提是假定內(nèi)參蛋白在實(shí)驗(yàn)條件下保持穩(wěn)定。內(nèi)參蛋白與目的蛋白與分子量需至少相差5KDa以上。常用內(nèi)參抗體分子量及定位：

IGF-1處理C2C12細(xì)胞檢測eEF2水平，發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)參蛋白對(duì)處理存在變異性：

4、如何正確的呈現(xiàn)WB圖片？
通常WB數(shù)據(jù)以代表性圖像的形式呈現(xiàn)，以反應(yīng)干預(yù)的效果和WB的質(zhì)量。這就存在呈現(xiàn)圖像時(shí)的倫理問題，論文中的WB圖像需要準(zhǔn)確呈現(xiàn)量化數(shù)據(jù)的結(jié)果。WB圖片呈現(xiàn)是學(xué)術(shù)不端的重災(zāi)區(qū)，例如來自多個(gè)WB的圖像的拼接以形成一個(gè)連續(xù)的圖像可能會(huì)模糊樣本之間的變化的大?。?/p>

此外過飽和的WB會(huì)導(dǎo)致感興趣的條帶之間沒有明顯的區(qū)別：

調(diào)整對(duì)比度以遮蔽雜帶（c）、圖像處理以增強(qiáng)、減少或移除條帶（d）也是不被允許的：

已發(fā)表SCI論文WB條帶存在問題舉例：

9.WB疑難解析

今天給大家分享WB注意事項(xiàng)就到此為止了，希望對(duì)大家有所幫助，祝大家一切順利！想要了解更多實(shí)驗(yàn)操作、試劑推薦、靠譜protocol以及PCR、IHC等常見實(shí)驗(yàn)疑難解析，歡迎掃碼免費(fèi)領(lǐng)取課程哦！