不得不知的昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)
昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，簡稱IBEVS (Insect Baculovirus Expression Vector System) ，是四大基因工程表達系統(tǒng)之一。由于其不具有任何對哺乳動物有潛在致病性的動物病毒片段, 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)問世以來，獲得了人們的高度重視。
美國食品藥品管理局對 BEVS 的評價為“FDA認可 BEVS 生產的產品，它提供了新興生物制藥業(yè)的前景，尤其對于人類疾病治療和疫苗的開發(fā)，改善人類的健康和提高數百萬人的生活質量更是如此”。
與前面AtaGenix介紹過的大腸桿菌、酵母以及后面將要介紹的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比，IBEVS 在以下四個方面具有特殊的研究價值：
1作為超高效的真核基因表達載體，生產有用的工程蛋白
2作為基因工程病毒殺蟲劑，提高害蟲防治效率
3研究桿狀病毒基因組的結構與功能
4研究真核基因表達的調控機制
近幾年來,昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)已成為生產與研究各種原核和真核蛋白有力而普及的工具。作為您身邊的蛋白表達服務專家，AtaGenix就將目前最經典的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)勢通通告訴你：
?優(yōu)勢稍多，請先喝一杯無名液體提提神~
1.由于重組病毒的分離是通過藍白斑篩選，不存在野生型和非重組型病毒污染的問題，因此不需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑分析來純化重組病毒。
2.很大程度上縮短了重組病毒構建所需要的時間且重組效率達到100%。
3.外源基因在昆蟲細胞內能進行正確折疊，表達出的目的蛋白結構上更接近天然蛋白，且具有完整的生物學功能。
4.昆蟲細胞能對翻譯后蛋白進行磷酸化、糖基化、?；?、信號肽切除及肽段的切割和分解等加工修飾。
5.桿狀病毒能容納大分子的插入片段，能包裝大的基因片段。
6.桿狀病毒表達系統(tǒng)具備在同一細胞內同時表達多個基因的能力，既可采用不同的重組病毒同時感染細胞，也可在同一轉移載體上同時克隆兩個外源基因，表達產物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。
7.昆蟲細胞懸浮生長，容易放大培養(yǎng)，有利于大規(guī)模表達重組蛋白。
8.桿狀病毒對脊椎動物無感染性，現有研究也表明其啟動子在動物細胞中沒有活性，因此在表達癌基因或有潛在毒性的蛋白時明顯優(yōu)于其他系統(tǒng)。
那么
??問題來了，
是什么樣的組成，
支撐起了
如此多的優(yōu)勢。
和你一起，看個究竟。
來看看它的幾個組成部分。
表達載體
AtaGenix的桿狀病毒表達系統(tǒng)采用pFastBac1載體為供體質粒，組裝具有Tn7L和Tn7R的左右兩臂序列，兩臂序列之間是多角體蛋白的PH啟動子，然后是多克隆酶切位點和SV4的Poly A位點。且pFastBac1供體質粒含有慶大霉素抗性基因便于篩選。
AtaGenix亦有pFastBac Dual來豐富您的選擇。其特點是在單個載體上有兩個啟動子，可以使用 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)同時在昆蟲細胞中表達兩個蛋白。該載體具有兩個強啟動子，多角體蛋白啟動子和 p10啟動子，可實現目的蛋白的高水平表達。
表達細胞器
昆蟲桿狀病毒既可在昆蟲培養(yǎng)細胞中，又可在昆蟲和蛹體內進行表達。究竟采用何種表達方式，可根據外源蛋白的性質及用途、表達水平高低、 分離純化難易、純化要求高低等因素來綜合考慮。然而，對于常規(guī)小量及高純度的蛋白質生產而言，利用體外培養(yǎng)的昆蟲細胞來進行表達是首選途徑。
目前應用最為廣泛的是草地貪葉蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細胞系 Sf21及其克隆株 Sf9 和粉紋夜蛾( Trichoplusia ni ) 胚胎細胞系 BTI-TN5B1-4，即我們熟知的High Five。High Five細胞株較 Sf9 及Sf21 有更多優(yōu)點，其細胞增殖一代所用時間更短，并且表達量更高，更適合于重組蛋白的表達。
AtaGenix實驗室依據多年探索經驗對sf9 （上圖為融合GFP標簽的目的蛋白在sf9細胞中的表達情況實拍——來自普健生物）和High Five細胞株進行了馴化，使其適合在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，且表達量大大提高。相對于胞內表達的細胞自身本底蛋白而言，分泌表達將大大減少它在純化過程所帶來的麻煩。
放大反應器
大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細胞的方法很多，綜合起來可分為兩種類型：貼壁細胞培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng)。由于昆蟲細胞體積大，形狀較不規(guī)整，容易結團，病毒感染后細胞會膨大1.5倍左右，導致昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)難度增加。但AtaGenix采用搖瓶、轉瓶氣升發(fā)酵罐和灌注培養(yǎng)等方法能在氣升式和渦旋攪動式生物反應器中大量懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞，規(guī)?？蛇_3-90 L，細胞倍增時間18-24 h，細胞密度可達5×106個/mL，與傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)相接近，可以滿足不同的實驗需求。
經典案例
AtaGenix一直致力于從以上各個方面進行昆蟲蛋白表達系統(tǒng)的優(yōu)化，其成果得到業(yè)界人士的一致肯定。例如，在AtaGenix利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)為客戶提供蛋白表達純化服務的一個案例中，經過P1代病毒生產及表達測試（見Figure 1）和P2代病毒生產及表達條件優(yōu)化（見Figure 2），目的蛋白的表達量達300 mg/L（見Figure 3），目的蛋白經客戶測試顯示有活性，服務效果遠遠超出了客戶的預期。
Figure 1.SDS-PAGE analysis of protein B for P1 expression.
SDS-PAGE: Coomassie blue Staining. 1 and 2 mean different clones；-. Negative control.
Figure 2. Protein B Expression Tests in sf9 and Hi5.?
Coomassie blue Staining. -. Negative control
Figure 3.Purification result and the final QC of?
Protein B.
Coomassie blue Staining.
作為您實驗室的最佳合作伙伴之一，AtaGenix將不遺余力地為您在科研道路上貢獻一份力量。我們希望您在技術的海洋中一帆風順，更希望當你需要遮風擋雨時，能想起我們這把傘。普健生物，一個專注蛋白表達和抗體定制的企業(yè)，術業(yè)有專攻，僅此而已。
