轉(zhuǎn)染是細胞實驗中廣泛使用的技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染可將外源核酸（DNA、RNA等）引入真核細胞，從而對基因的產(chǎn)物或其功能進行研究，是基因編輯細胞構(gòu)建必不可少的步驟。然而轉(zhuǎn)染效率不高的問題，總是困擾著許多新手小白，時常也會令頗有經(jīng)驗的細胞培養(yǎng)達人感到頭禿。

細胞轉(zhuǎn)染的效率跟哪些因素有關(guān)呢？總的來說可以概括為三個方面：

1) 細胞本身：包括細胞的種類、來源和代次等，這些信息基本決定了該細胞是否容易被轉(zhuǎn)染。

2) 轉(zhuǎn)染載體：轉(zhuǎn)染載體的大小、質(zhì)量和用量也對轉(zhuǎn)染效率有影響，對于不同大小的載體需要優(yōu)化不同的實驗參數(shù)或用量，在質(zhì)量方面需要對質(zhì)粒的濃度、純度和構(gòu)象、RNA是否降解等進行嚴格的把控。

3) 轉(zhuǎn)染方法和試劑：沒有一種轉(zhuǎn)染方法適用所有細胞，對于不同的細胞，選擇合適的轉(zhuǎn)染方法和試劑至關(guān)重要。

其中細胞和載體大家相對來說比較熟悉，今天小源主要從第3點轉(zhuǎn)染方法和試劑著手，給大家進行總結(jié)和分享。

首先，我們來盤點一下細胞轉(zhuǎn)染都有哪些方法？按照轉(zhuǎn)染的原理，大致可分為物理介導（如電穿孔法、顯微注射法、基因槍法）、化學介導（如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、陽離子聚合物介導法等）和生物介導（主要是各種病毒）三類。其中實驗室最常用的主要有物理介導的電穿孔法、化學介導的脂質(zhì)體法和生物介導的慢病毒法。

脂質(zhì)體法：

脂質(zhì)體通過表面的正電荷與核酸磷酸基團的負電荷相互作用形成內(nèi)包DNA分子的復合物，復合物表面帶正電，會被帶負電的細胞膜所吸附，進而通過融合或細胞內(nèi)吞完成外源DNA分子的導入，是目前實驗室最方便的轉(zhuǎn)染方式之一。

具體過程分為幾步：

1) 轉(zhuǎn)染試劑與核酸在體外孵育時形成帶正電荷的復合物。

2) 復合物被添加到細胞中，通過靜電相互作用與帶負電的細胞表面結(jié)合。

3) 細胞通過內(nèi)吞作用將復合物內(nèi)化到稱為內(nèi)體的膜囊泡中。

4) 轉(zhuǎn)染試劑使內(nèi)體膜不穩(wěn)定。

5) 復合物從內(nèi)體中逸出并在細胞質(zhì)中釋放核酸（siRNA、miRNA 或大RNA通常在細胞質(zhì)中具有活性）。

6) DNA 必須定位于基因表達盒轉(zhuǎn)錄的細胞核。

電穿孔轉(zhuǎn)染法：

電穿孔法通過高強度電場引起細胞膜電位變化，瞬時提高細胞膜通透性，使細胞膜上產(chǎn)生可逆性小孔便于外源核酸的進入（圖2），適用于幾乎所有類型的細胞，是目前一種較為強大的轉(zhuǎn)染方式。目前市面上比較常用的電轉(zhuǎn)儀品牌有Thermo的Neon、Lonza的Nucleofector系列、Bio-rad電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，還有后起之秀Celetrix等。

慢病毒轉(zhuǎn)導法：

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，能夠轉(zhuǎn)導非分裂細胞和分裂細胞。人類免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 是研究得最多的慢病毒。具體過程為：

1）通過將基因工程改造的目的質(zhì)粒與病毒包裝所需的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293T工具細胞，生產(chǎn)細胞轉(zhuǎn)導所需的慢病毒顆粒。

2）將慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染靶細胞，慢病毒表面包膜蛋白與細胞受體結(jié)合進入細胞。

3）慢病毒RNA被逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。

4）雙鏈DNA與整合酶形成預整合復合物，再通過核孔復合物進入細胞核內(nèi)。

5）整合酶將慢病毒LTR之間的部分整合到細胞基因組上。

6）整合的外源DNA開始轉(zhuǎn)錄，表達目的基因。

了解了三種轉(zhuǎn)染方法的基本原理，接下來小源還幫大家歸納了它們各自的優(yōu)缺點。

那么問題來了，如果你剛拿到一種新的細胞，怎么確定使用哪種轉(zhuǎn)染方法呢？

1.了解細胞：首先，要從細胞供應商或網(wǎng)上查詢細胞背景，了解細胞的來源、特性、培養(yǎng)條件、代次和增殖時間等信息，對細胞有個初步的了解。

2.參考轉(zhuǎn)染案例：找到成功的轉(zhuǎn)染案例做參考可以讓你少走彎路！一方面可以跟轉(zhuǎn)染試劑供應商或電轉(zhuǎn)儀器供應商溝通，詢問對方是否有做過該細胞轉(zhuǎn)染測試，效率和參數(shù)是怎么樣的。另一方面可以在網(wǎng)上檢索文獻資料，看是否有人對該細胞進行過轉(zhuǎn)染操作，使用的什么方法，操作流程是怎樣的，轉(zhuǎn)染效率如何。最后結(jié)合實驗室的具體情況，優(yōu)先選擇現(xiàn)有儀器和試劑可滿足的轉(zhuǎn)染方法進行效率測試。

3.預實驗：做好以上準備，我們就可以開始預實驗摸索最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)了，一般使用帶熒光標記的載體進行轉(zhuǎn)染率的驗證。按照事先查好的資料或者供應商提供的轉(zhuǎn)染protocol對細胞進行轉(zhuǎn)染測試，測試時一般測多組實驗參數(shù)（比如脂質(zhì)體法測DNA與轉(zhuǎn)染試劑不同用量比例、電穿孔測試不同的電轉(zhuǎn)參數(shù)，慢病毒法測試不同的MOI），轉(zhuǎn)染24h-48h后觀察轉(zhuǎn)染率，選擇效率最高且細胞狀態(tài)良好的一組進行后續(xù)正式實驗。如果最高的一組轉(zhuǎn)染效率都不足30%，排除操作問題的情況下，可能是該方法不適用于這株細胞，建議更換其他轉(zhuǎn)染方法。

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參考文獻：

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