RNAi在害蟲防控應用中實驗參數的設計與指導

RNAi技術通過抑制靶標物種特定的基因，導致發(fā)育缺陷、死亡和行為改變，進而達到害蟲防控的目的。但是目前對于RNAi技術在害蟲防治中的研究不太規(guī)范。該論文對于已經發(fā)表過的實驗數據，通過機器學習算法分析，預測與RNAi試驗有效性相關的因素。結果表明，針對于RNAi實驗，響應時間和目標基因是最重要的變量，其次是dsRNA使用劑量、dsRNA長度以及所選擇的目標物種（圖?1）。該篇論文對標準化RNAi實驗開展提供一定的指導，以加速RNAi作為防治害蟲的有效工具的開發(fā)。

該研究共調查了350篇論文，經過篩選，82篇研究RNAi害蟲防治的文章被用來進一步分析。結果共包含979個數據點，來源于8個目的54種昆蟲。

?靶標基因

靶標基因是影響RNAi效率的重要因素。首先將不同昆蟲的靶標基因進行分析，使用果蠅的同源基因進行命名后，歸一處理后靶標基因數目為192個，其中Vha及其subunits在數據集中數量最高（n = 51），占所有使用的目標基因的7.4%。統(tǒng)計分析后，Vha、Ace、chitinase、COPI coatomer和cellulase是研究最多的五類靶標基因，占基因總數的24.5%（圖?2）。

使用較低劑量（0.027~24 μg）的dsRNA，抑制Vha基因，對雙翅目、鞘翅目、半翅目、和鱗翅目昆蟲的平均致死率為70%±26.7%。

響應時間

不同研究報告顯示RNAi實驗產生最大死亡率的時間不同。例如，在煙粉虱中，抑制Vha基因的表達，48h死亡率能夠達到70%。但是，在溫帶臭蟲中，使用0.5~0.05μg的dsVha注射處理，28天后死亡率達到80~85%。在德國小蠊中，通過飼喂的方法，抑制tub基因的表達，16天后，死亡率大于60%。飼喂鱗翅目昆蟲美洲棉鈴蟲針對PBAN基因的dsRNA，20天后，死亡率達到70%以上。這些結果表明，實驗的持續(xù)時間對死亡率似乎有明顯的影響。

dsRNA長度

在RNAi實驗中，用到的dsRNA長度各異，多數是100bp到800bp之間，甚至包含1872bp的全長CDS全長序列。對dsRNA長度分析統(tǒng)計顯示，125bp~628bp之間的序列，能夠引起有效的RNAi效應。

此外，在果蠅細胞系中，針對于Sid1基因的研究表明，使用100bp的dsRNA，相比與500bp的dsRNA，需要100到1000倍的劑量才能達到相同的沉默效果。

對秀麗隱桿線蟲、雙斑點線蟲、葉螨、赤擬谷盜等進行試驗分析發(fā)現，目前對無脊椎動物的研究結果表明，最佳的dsRNA長度可能在100~ 600 bp之間。

?昆蟲類型

具有較高RNAi效率的昆蟲，研究的也就更多。目前文獻中，對于鞘翅目，其次是鱗翅目和半翅目昆蟲研究的最多，這三類昆蟲中，不管是通過注射還是飼喂dsRNA，均能夠引起較強烈的RNAi效應。其它目的昆蟲研究的相對較少。直翅目、纓翅目、雙翅目和膜翅目的代表性較低。在所有被調查的目的昆蟲中，RNAi引起的昆蟲死亡率各不相同。同時，很多目的昆蟲的RNAi通路核心基因已經被證實，但是在直翅目和雙翅目中，對于其核心機制以及系統(tǒng)性了解的缺乏，可能限制了RNAi效應。

使用劑量

應用于昆蟲的dsRNA劑量在數據集中范圍很廣，統(tǒng)計結果表明沒有發(fā)現劑量效應對死亡率的明顯證據。然而，也有個別報告顯示劑量與死亡率之間存在正線性關系。報道的最低使用劑量是將cactus基因的dsRNA注射進赤擬谷盜中，使用的dsRNA長度為485bp，劑量為1.5E-08μg。該劑量在16天內導致目標昆蟲75%的死亡率，劑量提高100倍后，能夠使得死亡率增加到90%。此外，針對于4齡東亞飛蝗，注射20μg針對于Dicer基因的dsRNA，引起的死亡率達到64%，這個劑量與已經報道的最少使用劑量相差13億倍。而在斜紋夜蛾成蟲中，針對于PBAN基因注射高劑量的dsRNA，引起的致死率為0%。

飼喂劑量不能像注射一樣量化，因為不確定有多少可用的dsRNA被昆蟲攝取。但是可誘導死亡的dsRNA劑量的變化比注射試驗窄，最大和最小劑量之間的變化范圍為800倍（最小= 0.5μg，最大= 400μg）。在玉米根蟲成蟲中，在飼料中使用0.5μg針對于Laccase2和Vha的dsRNA，能夠引起目標昆蟲高達60%的死亡率。在飼喂實驗中，用到的最高劑量是針對于東方果蠅核糖體蛋白RpL基因的dsRNA，使用劑量達到400 μg，然而并沒有產生明顯的致死效應。

使用方法

針對于調查數據來看，飼喂dsRNA是最常見的方法（n = 441），其次是注射dsRNA（n = 431）。統(tǒng)計分析結果顯示，飼喂似乎顯示了與注射相似的死亡率。飼喂方法包括人工飼料、轉基因植物、浸漬葉片、轉基因細菌、簡單dsRNA溶液，均能引起顯著的死亡率（高達100%）。

?該研究論文通過對相關研究結果的統(tǒng)計分析與總結，確定了能夠影響昆蟲RNAi效率的因素，為RNAi技術在害蟲防治中的應用提供一定的幫助。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/ps.6884