圖1 腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程

1.?????? 識(shí)別細(xì)胞表面受體

腺病毒是一種無(wú)包膜病毒，主要是通過(guò)病毒衣殼表面的纖突蛋白來(lái)識(shí)別細(xì)胞表面的CAR受體，并與之結(jié)合。（CAR：柯薩奇病毒和腺病毒受體）

2.?????? 細(xì)胞內(nèi)吞

隨后衣殼表面五鄰體蛋白上的RGD氨基酸與細(xì)胞膜表面的整合素αvβ3和αvβ5相互作用，在CAR介導(dǎo)下形成內(nèi)吞體將病毒顆粒包裹，從而內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。

3.?????? 衣殼構(gòu)象變化

細(xì)胞內(nèi)吞體的酸化作用使得病毒衣殼構(gòu)象發(fā)生改變，并將病毒顆粒釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

4.?????? 病毒基因組入核表達(dá)

釋放出來(lái)的病毒顆粒會(huì)與細(xì)胞核上的核孔復(fù)合物結(jié)合，把病毒基因組釋放到細(xì)胞核中，接著利用宿主細(xì)胞中的原料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)出相應(yīng)的外源基因。

? ??二、腺病毒載體感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

使用病毒載體感染細(xì)胞前，通常需要先做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索一下最佳感染復(fù)數(shù)（即MOI），可以通過(guò)參考文獻(xiàn)提供的MOI值設(shè)計(jì)梯度摸索，感染后觀察熒光或檢測(cè)目的基因表達(dá)情況（若病毒不帶熒光），感染效率80%左右且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的條件即可確定為最佳MOI。下面是腺病毒感染細(xì)胞的步驟：

1.?????? 細(xì)胞準(zhǔn)備：將細(xì)胞接種至所需細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過(guò)夜培養(yǎng)，保證第二天進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞密度介于30%~50%之間。

2.?????? 病毒感染（1/2小體積感染法）及換液：感染前，從冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)摸索的MOI值，加入合適體積的病毒輕輕混勻，進(jìn)行感染，4h后補(bǔ)足至完全培養(yǎng)的體積。感染后10-16h，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。（注：1/2小體積感染法可一定程度上提高感染效率；也可以采用正常體積的培養(yǎng)基去感染）

3.?????? 觀察熒光：感染后24-48 h，對(duì)于帶GFP報(bào)告基因的病毒，可通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)GFP表達(dá)效率。如果病毒不表達(dá)熒光，可以通過(guò)目的基因的qPCR、WB、免疫熒光、免疫組化等方法判斷感染效率及基因表達(dá)情況。

以上是貼壁細(xì)胞感染腺病毒的一般步驟，如果需要感染懸浮細(xì)胞，則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法：

先重懸細(xì)胞，然后將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后，封好口，放入平角離心機(jī)，1000g離心60-90min（離心30min暫停一次，間隔10min繼續(xù)離心，重復(fù)2-3次），然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)即可。若實(shí)驗(yàn)條件有限，沒(méi)有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吹打吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，然后加入適量的病毒液，室溫放置15 min（盡量不要超過(guò)30 min，間隔10min可以再吹打一次），然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過(guò)夜即可。原代細(xì)胞不同批次可能會(huì)存在差異，病毒感染MOI建議進(jìn)行摸索實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于極難給感染的細(xì)胞，如樹突細(xì)胞等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，直接二次加入病毒液進(jìn)行重復(fù)感染，可顯著提升感染效率。

以上便是腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程及實(shí)驗(yàn)步驟，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)?zāi)苡兴鶐椭?。如有病毒需求或有相關(guān)問(wèn)題歡迎隨時(shí)與我們聯(lián)系。