隨著關(guān)注CRISPR/Cas9 技術(shù)的人越來越多，我們也收到了來自不同地區(qū)想嘗試CRISPR/Cas9 技術(shù)的人的提問，我們將這些問題進(jìn)行匯總與解答，并開通了新的郵件欄目，每周將根據(jù)不同主題挑選三個值得分享的問題，以期能幫到更多想要了解與使用CRISPR/Cas9 技術(shù)的人！

問：請問一下，利用CRISPR/Cas9技術(shù)做基因敲除的時候?yàn)槭裁匆油幢郏?/h1>

答：首先，加入同源臂主要是用于細(xì)胞點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，通過在突變位點(diǎn)兩側(cè)加入同源臂，讓事先設(shè)計(jì)好的突變位點(diǎn)整合到基因序列上，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。不過一般對微生物進(jìn)行基因敲除時需要加上同源臂，以修復(fù)斷裂后的基因；而對哺乳動物進(jìn)行基因敲除時是不需要添加同源臂的。

問：請問CRISPR/Cas9技術(shù)怎樣同時敲除兩個基因，以及后續(xù)怎樣篩選雙陽性細(xì)胞？

答：首先，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行雙基因敲除時一般有兩種方式：

1、先構(gòu)建單基因KO細(xì)胞系，再構(gòu)建第二個基因的細(xì)胞系；

2、同時轉(zhuǎn)兩種基因的gRNA，實(shí)現(xiàn)雙基因同時敲除。第一種方法的優(yōu)點(diǎn)是篩選陽性率高，并且還能夠獲得一個單敲的細(xì)胞株，豐富實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但是周期比較長；第二種的實(shí)驗(yàn)周期比較短，但是陽性率不高，可能會出現(xiàn)一直無法篩選到雙陽性克隆的情況。所以我們公司在進(jìn)行雙基因敲除服務(wù)時都會根據(jù)客戶的具體情況選擇最佳的方式，以確保敲除的成功。另外我們還能對超5000個基因的敲除保證WB。

關(guān)于第二個問題，如何鑒定雙陽性的方法其實(shí)和鑒定單敲的差不多，都可以選擇PCR、測序或WB來進(jìn)行鑒定；具體操作流程建議可以考慮先構(gòu)建出Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，然后再分別轉(zhuǎn)不同的gRNA或者同時轉(zhuǎn)兩種基因的雙gRNA病毒。

問：利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除時怎樣有效的防止脫靶現(xiàn)象？

答：首先CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶率不高，因?yàn)間RNA的打靶規(guī)則比較嚴(yán)格的，需要有PAM位點(diǎn)才能完成打靶，相比于RNAi技術(shù)來說，脫靶率是低了很多的；但事實(shí)上仍存在脫靶的可能性，所以我們在設(shè)計(jì)方案的時候，需要選擇特異性分?jǐn)?shù)比較高的gRNA來降低脫靶率。如果在gRNA設(shè)計(jì)過程中遇到了問題，可以嘗試使用我們紅棉系統(tǒng)的gRNA設(shè)計(jì)功能（點(diǎn)擊立即查看使用方法）；另外也可以在篩選單克隆的時候，盡量篩選多一些陽性克隆，利用不同的克隆來排除脫靶問題的影響。